MstLab olarak CRISPR çalışmalarınız için üç farklı pakette alanında yetkin bilim insanları ile sizlere destek verebilmekteyiz.
Paket A: Projelerinizi tasarlayabilmeniz için danışman hocalarımız tarafından sizlere destek sağlanmaktadır. Proje gizliliği esas tutularak yapmak istediğiniz gen düzenleme çalışması hakkında bilgiler alabilir, projeniz için iş-paketi oluşturabilirsiniz.
Paket B: Hali hazırda projesi ve/veya proje fikri bulunan, belirli bir gen bölgesini hedef alıp bu bölge ile ilgili vektör seçimi, sgRNA (rehber RNA) dizaynı yapmak isteyen araştırmacılar faydalanabilirler. Projenize uygun vektör seçilerek, vektörünüze göre alternatif bölgeleriyle birlikte sgRNA tasarımı gerçekleştirilir.
Paket C: Projeniz için vektör ve sgRNA seçimini yaptınız fakat klonlama ve vektör çoğaltımı için laboratuvarımız hizmet desteğine ihtiyacınız var ise sadece Paket C’den faydalanabilirsiniz. Yetkin teknik elemanlarımız ve danışman hocalarımız ile belirlemiş olduğunuz vektörünüze sgRNA klonlama işlemi gerçekleştirilir. Vektörünüze uygun kompotent hücre suşları seçilerek klonlanmış olan vektörler çoğaltılarak size ister kompetent hücre ile isterseniz saf halde gönderilir. Bu işlemler sonucunda vektörleriniz için sekanslama, jel görüntüleme sonuçları da sizlerle paylaşılacaktır.
Projeniz için Paket A,B ve C’den ayrı ayrı ya da aynı anda faydalanabilirsiniz. Ayrıca devam eden çalışmalarınızda gen düzenleme sonuçlarını görselleştimek ve kanıtlamak üzere yapmayı planladığınız çalışmalar için de laboratuvarımızda destek vermekteyiz. Sekanslama, western blot analizi, immünohistokimya, RT-PCR gibi çalışmalarımız ile gen düzenleme çalışmalarınızı destekleyebilmekteyiz.
CRISPR Nedir?
CRISPR açılımı (Clustured Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) ve türkçesi (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrar)’dır.
Bakteriler Virüs genomunu CRISPR denilen DNA arşivinde saklarlar ve virüs tekrar saldırdığında bakteri DNA’sından hemen virüse özgü bir RNA kopyası çıkartır. Cas proteini adı verilen bir silahla bu RNA kuşatılır. Protein hedef RNA sayesinde yabancı DNA’yı tarayarak mükemmel eşleşmeyi yakaladığı anda protein aktifleşir ve yabancı DNA’nın parçalanması sağlanır. Faj DNA’sı bakteri tarafından parçalanarak, bakteri kendini yabancı fajlardan korumaktadır. Bu mekanizma araştırmacılar tarafından keşfedilerek günümüzde çok daha kolay ve ucuz bir şekilde gen düzenlenmesi yapılabilmesini sağlamıştır.
CRISPR’ın Keşif Süreci
Tekrarlayan CRISPR dizileri ilk olarak 1987 yılında E.Coli’ nin genomunda keşfedilmiştir fakat bir işlevi olup olmadığı o zamanlarda bilinmemektedir. 90’lı yılların başında dizilere ilk CRISPR adını koyan araştırmacı ise İspanyol bilim adamı Francisco Mojica’dır [1].
2000’li yıllara gelindiğinde Danisco yoğurt ve peynir üretimi tesislerinde araştırma yapan bilim insanları verimsiz üretim sonuçlarının bakterileri enfekte eden virüslerden kaynaklandığını gördüler. Daha verimli yoğurt ve peynir üretmek amacıyla bir çalışma gerçekleştirdiler. S.thermophilus bakterisini farklı fajlara maruz bırakıp içlerinden hayatta kalan bakterileri seçtiler. Böylelikle elde edilen en son bakteri suşu birçok virüse karşı dirençli olmuş oldu. Araştırmacılar bu işlemlerden sonra elde edilen bakterilerde CRISPR dizilerinin değiştiğini ve CRISPR dizilerinin aralarında bulunan DNA bölgelerinin bakterinin maruz kaldığı fajlardan geldiğini keşfettiler [2]. 2011 yılına gelindiğinde Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier’in labı ile kollaborasyon kurarak, CRISPR sistemi ile ilk DNA kesimini gerçekleştirdi. 2012 yılı Haziran ayında Jennifer ve Emmanuel RNA temelli DNA kesimini gösteren makalelerini yayınlarken, Feng Zang memeliler üzerinde CRISPR sistemini 2013 Ocak ayında yayınlamıştır[3,4].
CRISPR/Cas9
Tasarlanmış CRISPR sistemleri iki bileşen içerir: bir kılavuz RNA (gRNA veya sgRNA) ve CRISPR ile ilişkili bir endonükleaz (Cas proteini). gRNA, Cas-bağlama için gerekli bir iskele dizisinden ve değiştirilecek genomik hedefi tanımlayan kullanıcı tanımlı bir ∼20 nükleotitden oluşan kısa bir sentetik RNA'dır. Böylece, gRNA'da mevcut olan hedef sekans değiştirilerek Cas proteininin genomik hedefi değiştirilebilir (Şekil 1).
CRISPR başlangıçta çeşitli hücre tiplerinde ve organizmalarında hedef genleri çıkarmak için kullanılmıştır, ancak çeşitli Cas enzimlerinde yapılan değişiklikler, CRISPR'ı hedef genleri seçici olarak aktive etmek/bastırmak, DNA'nın spesifik bölgelerini belirlemek, canlı hücrelerin DNA'sını görüntülemek ve DNA, RNA’yı hassas bir şekilde düzenleyebilmektedir. Ayrıca, gRNA üretme kolaylığı CRISPR'ı en üstün genom düzenleme teknolojilerinden biri yapmaktadır.
Şekil 1. Cas9 Enzimi ve sgRNA şematize hali. Görsel addgene.com adrsinden alınmıştır. (this image was taken from addgene.com)
Cas9 ya da Cas12 (Cpf1 olarak da bilinmektedir) gibi endonükleaz enzimlerini hedef gene özgü gRNA’lar ile yönlendirerek hücreleri ya da deney hayvanlarını knock-out yapabilirsiniz. Hedef gene özgü yaklaşık 20 nükleotitlik DNA sekansı 2 koşulu sağlamak zorundadır:
1- Genomda hedef gen dışında farklı bir bölge ile eşleşmemesi gerekir.
2- Hedef sgRNA’niz içeresinde bir Protospacer Bitişik Motifi (PAM) bulunmalıdır.
Cas9 ve gRNA birleşimi ile bir ribonükleoprotein kompleksi oluşur. Bu motifin oluşmasında PAM sekansı önemli bir rol oynamaktadır. PAM bölgeleri Cas9 enziminin alındığı organizmaya göre değişmektedir. PAM sekansı aracılığı ile Cas9 enzimi ile ribonükleoprotein kompleksi oluşturan gRNA, kompleksin DNA’ya bağlanmasını sağlar. Tam eşleşme gerçekleştiğinde Cas9 enzimi aktifleşir ve DNA’yı keser.
DSB (Çift iplik kesimi) gerçekleşir. Kesim sonrası 2 onarım tipinden biri ile DNA onarımı gerçekleşir (Şekil 2).
1- Homolog olmayan uçların birleşmesi (NHEJ).
2- Homoloji yönlendirmeli tamir (HDR).
Şekil 2. Cas9 ribonükleoproteinin hedef gen bölgesinin kesimi. (Görsel addgene.com adresinden alınmıştır. This image was taken from addgene.com)
Gen ifadesini baskılama, kaldırma, arttırma gibi birçok farklı gen düzenleme işlemini CRISPR tekniği ile gerçekleştirebilirsiniz. Ayrıca aynı anda 2 ya da daha fazla gen bölgesini CRISPR tekniği ile hedefleyebilirsiniz.
Kaynakça
[1] R.H.J. Staals, S.J.J. Brouns, Distribution and mechanism of the type I CRISPR-Cas systems, 2013. doi:10.1007/978-3-642-34657-6.
[2] E.S. Lander, The Heroes of CRISPR, Cell. 164 (2016) 18–28. doi:10.1016/j.cell.2015.12.041.
[3] M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, A. Jennifer, M. Jinek, I. Fonfara, I. Fonfara, A. Jennifer, Linked references are available on JSTOR for this article : Dual-RNA-Guided A Programmable Programmable DNA in in Adaptive DNA Endonuclease Endonuclease Adaptive Bacterial Immunity Immunity Bacterial, Science (80-. ). 337 (2018) 816–821. doi:10.1021/cm802606s.
[4] L. Cong, F.A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, P.D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, L. a Marraffini, Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., … Zhang, F. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science (New York, N.Y.), Science. 339 (2013) 819–823. doi:10.1126/science.1231143.Multiplex.
